咖啡因介绍
咖啡因是从咖啡或茶叶中提取的生物碱，具有兴奋中枢神经系统的作用，但长期或超量摄入有害。茶饮料中常含咖啡因，因此检测其含量至关重要。《茶饮料》标准中有相关规定。本文基于国家标准方法，结合阿斯曼尔设备，建立了一套快速、高效的茶饮料咖啡因含量测定法，采用HPLC分析和外标法定量，并通过加标回收验证，利用全自动液体工作站改善实验结果。
关键词
茶饮料，含量测定，咖啡因，液体工作站，HPLC
仪器及耗材
仪器： FlexStation P4-S1全自动液体工作站 高效液相色谱仪（岛津 SPD-20A） 液相色谱柱(C18）或同等性能的色谱柱 0.22μm微孔水相滤膜(上海安谱) 电子天平(精度0.1 mg，赛多利斯) |
耗材： 茶饮料(购自某超市) 甲醇（HPLC级，麦克林） 纯水 甲醇中咖啡因标准溶液（500 mg/ml ，北方伟业） 氧化镁(AR级，鼎盛鑫化工) |
实验步骤
咖啡因标准溶液的配制  以500 μg/ml咖啡因标准溶液为源液，纯水定容，于室温平衡后用P4-S1的外标曲线功能配制成浓度分别为1、5、10、20、40、100和200 μg/ml的系列标准溶液。  试样处理 准确称取5g(精确至0.001g)样品，加纯水定容至10ml(使样品溶液中咖啡因含量在标准曲线范围内),摇匀，加入0.5 g氧化镁，迅速上下振摇，使氧化镁和待测茶饮料充分混匀，静置待上层澄清，取1ml上清液经0.22μm微孔滤膜过滤待测。 液相色谱条件
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实验结果
标准物质的定性和定量 按照上述检测波长和流动相条件，用5 μg/ml的咖啡因标准品进行定性，进样量10 μl。标准溶液的色谱图见下图。咖啡因的出峰时间为5.258 min, 且标准品峰形对称。  标准溶液色谱图 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
线性关系考察 将配制的质量浓度为1、5、10、20、40、100和200 μg/ml的标准系列溶液按照2.3液相色谱条件上机测试，咖啡因的质量浓度(x)为横坐标，其对应测得的色谱峰面积(y)为纵坐标，绘制标准工作曲线，计算曲线方程和线性系数。如图所示。图中表明咖啡因在1～200 μg/ml范围内有良好的线性关系。按照国标《食品安全国家标准饮料中咖啡因的测定》(GB 5009.139—2014)的方法中茶饮料的称样量和定容体积，代入国标方法的计算公式可得，茶饮料的检出限均为0.6 mg/kg, 定量限为2 mg/kg。  咖啡因标准曲线图 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
加标回收率 称取9份阴性茶饮料，结合方法的线性范围向1～3号试样中添加0.5 mL浓度为1.96 μg/mL的咖啡因标准溶液，按照试样处理过程操作，液相色谱条件测试，计算方法的加标回收率。向阴性茶饮料中添加0.15 mL浓度为1963.04 μg/mL的咖啡因标准溶液，平行测定6次，考察方法的重复性(用相对标准偏差RSD表示)，方法的重复性RSD为1.56%，具体见下表。由此可见，方法的加标回收率与重复性均满足GB/T 27404—2008中的规定，测定结果准确可靠。
咖啡因的加标回收试验结果统计(n=3) |
结果验证
为了验证该方法的准确度与精密度，本实验用已知咖啡因含量的复方对乙酰氨基酚片进行验证（n=3）。测试结果如下表，相对标准偏差0.48%。
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总结
综上所述， 本方案标准曲线的配置我们采用全自动液体工作站（FlexStation P4-S1），可实现混标制备、标准曲线制备、样品添加和分液等液体样品处理功能，全程无需人员值守，仪器程序化运行可以有效避免人为误差，保证曲线的精密度和准确性。
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